中国检验检疫仪器网
您当前的位置>>仪器展厅>>
Western Blotting实验技术对外服务

产品型号:

供应商报价:面议

样本:

产地:

更新时间:2016-09-28 14:47:19

分享到: 更多
  • 产品简介
  • 相关资料
  • 相关仪器
  • 相关耗材
 Western Blotting实验技术对外服务(传统方法)

 

简介:免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting),它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的

免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,现已成

为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。

主要实验步骤如下: 

1. 蛋白质抽提       2. 蛋白质定量             3. 变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)  

4. 蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜          5. 膜的封闭和抗体孵育          6. 结果检测

7. 数据分析                                                            8. 提供实验报告

仪器与试剂:

1.仪器

高速组织捣碎机:SWISS KINEMATIC Ltd. Co(型号:PT1600E)

电泳仪:北京六一仪器厂(型号:DYY-8C)

电泳槽:北京六一仪器厂(型号:DYCZ-24D)    

转印槽:北京六一仪器厂(型号:DYCZ-40D)

低温高速离心机:湖南湘仪公司(型号:H2050R)

超低温冰箱:美国FORMA公司(型号:702)

分光光度计:上海分析仪器总厂(型号:721)

脱色摇床:上海琪特分析仪器有限公司(型号:STS-2)

操作流程:

1样品准备

1)分别取大约200mg组织加入液氮碾磨成粉末状,按每200mg组织加900μl上样Buffer(无溴酚蓝)和100ul 10mg/ml PMSF,混匀,玻璃匀浆器冰点匀浆

2)4℃,12000rpm离心10min

3)取上清夜-70℃冻存24hr

5)4℃12000rpm再次离心10min,取上清分装,一份用于定蛋白,另一份加入溴酚蓝(0.1%(W/V))后于100℃加热4min,后于-20℃保存待用。

2定蛋白及计算电泳上样量

根据总蛋白测定试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量,电泳上样量定为40ug

3电泳

1)安装好电泳装置

2)根据不同的指标配制相应浓度的分离胶,灌胶约3/5体积,液封(<10%用0.1%SDS,>10%用异丙醇)

3)30min后,待凝后倾去封液

4)配5%的浓缩胶,灌胶至距平板顶部2mm处,插入梳子, 30min后,待凝后拔出梳子,用去离子水清洗加样孔,用滤纸吸干

5)上样:各样品取50ug上样,marker取10μl上样(上样前需按说明书进行预处理)

6)缓慢加入内、外槽缓冲液,接通电源,90v电泳至指示剂进入分离胶后,调电压至150V继续电泳

7)当指示剂距平板底端1cm处时停止电泳

4 转膜及检测

1)准备2个Φ12cm的平面皿,一个装去离子水浸泡NC膜20min,另一装转移缓冲液浸泡海绵和滤纸20min

2)取下胶,切除浓缩胶部分后,将分离胶浸入转移缓冲液中约5min

3)按顺序安装好转膜装置(黑色板-海绵-三层滤纸-凝胶-硝酸纤维膜-三层滤纸-海绵-红色板)

4)完全排除气泡,4℃,100mA转膜2hr。

5)倾去转膜缓冲液,拆除转膜装置,将硝酸纤维膜放入丽春红中摇床染色15min,用去离子水清洗至能看到条带,后用铅笔标出marker位置,再用去离子水震荡以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右

6)将膜转移至另一容器中,用5%脱脂奶粉封闭, 4℃过夜

7)将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的一抗

8)37℃摇床孵育约2hr

9)PBST洗涤4次,每次5min

10)将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的二抗,37℃摇床孵育约30min

11)PBST洗涤4次,每次5min

12)将膜转移至尽可能小的容器中并加入BCIP/NBT底物,室温孵育30min

13)取出NC膜,用蒸馏水漂洗后晾干

14)扫描及分析

服务要求:

  • 样本要求:组织样品,每份样本约250-500mg,新鲜或正确保存的组织。细胞样本:每份样本:1*10 6-1*10 7细胞数。 
  • 客户提供有效的一抗,(国产抗体一般不接纳) 一抗自备或代购。
  • 客户提供欲检测目的蛋白的详细背景资料。以及提供样本的种属,类型。

结果提供:

  • 目的蛋白实验图片。
  • 灰度分析结果。(免费分析) 
  • 内参结果。(免费跑胶)
  • 详细的实验步骤。
  • 免费提供蛋白样本保存液。

完成时间:

接受样本后,1月以内。

注意事项:

1、客户要确保模型建造的成功性。

2、客户要确保抗体的有效性。

3、如要加快的客户可以和我们联系沟通。

4、收费标准:以每张膜8个样本收费,不足8个样本的按8个样本收费)

 

 

 

实验预约联系方式:

     全国免费电话:400-675-6758                                  QQ   1029803407    83765681

     销售热线:    023-65316016      15998909965(肖)

     销售邮箱: 3western@163.com       western-2@163.com  

技术热线:  15826175288(周)      技术邮箱huameixinan@163.com

Instrument.com.cn Copyright @ 1999-2011,AllRights Reserved 版权所有中国检验检疫仪器网,未经书面授权,所有页面内容不得以任何形式进行复制